ДЕЙСТВИЕ ПЕРВОЕ
Церковь Сант-Андреа делла Валле, Рим, 1800 год.
Внутрь вбегает бежавший политический заключённый, измученный и оборванный. По перебираемым вслух наставлениям свой сестры, маркизы Аттаванти, находит спрятанный у ног Мадонны ключ и прячется в семейной капелле. В эту же секунду заходит Ризничий, принесший кисти и еду для художника. Непрерывно жалуясь на необходимость помогать и усталость, он вдруг слышит колокольный звон и тут же падает на колени для молитвы. В этом положении его застает вернувшийся Марио Каварадосси. Написанный портрет Марии Магдалины ужасно похож на прихожанку церкви Аттаванти, так что между двумя происходит диалог, в котором художник восхваляет красоту девушки, находя в ней черты своей возлюбленной, певицы Флории Тоски, а ризничий возмущенно бранит его за подобные вольнодумства в священном месте: «За шутки эти быть тебе в ответе». В конце разговора художник упоминает, что у него нет аппетита к принесенной в корзине еде, и ризничий удаляется. После этого Анджелотти уже может раскрыть себя и свой план побега художнику, Марио обещает ему помочь, но успевает только отдать корзину с едой и оправить обратно в капеллу, когда приходит Флория Тоска. От вида знакомой девушки на портрете певица страшно расстраивается и ревнует, но признания в любви и обещание вечерней встречи её успокаивают. Когда она уходит, Каварадосси и Анджелотти забирают женскую одежду-прикрытие и отправляются в дом к художнику.
Приходят новости о поражении Наполеона. Ризничий и певцы ликуют. В момент радости шеф полиции Скарпиа со своим помощником Сполетта приходят обыскать церковь в поисках беглеца и обнаруживают случайно забытый веер с гербом Аттаванти и пустую корзину для еды. Нить, которую немало помог протянуть ризничий, ведёт к художнику, так что когда Тоска возвращается, желая сообщить об отмене встречи, Скарпиа решает одним выстрелом вызвать в ней ревность, тем самым завладев её сердцем, и узнать местоположение художника. Обманутая и опечаленная Тоска идет искать любимого, и за ней отправляют слежку.
ДЕЙСТВИЕ ВТОРОЕ
Палаццо Фарнезе. Кабинет Скарпиа.
Сполетта сообщает, что в домике никого кроме самого художника не обнаружилось, но его всё равно взяли под стражу. Каварадосси приводят в кабинет, но он продолжает отпираться и дерзить. Следом с праздника в честь победы прибегает Тоска. Задержанного уводят на допрос, и теперь уже очередь Флории, пообещавшей молчать, утаивать правду от властей. Вскоре становится понятно, что художника не просто допрашиваю, а пытают: Скарпиа приказывает открыть двери, чтобы Тоска могла это слышать. Признание девушки и раскрытие местоположения Анджелотти означают приговор для художника, но начальник полиции предлагает ей сделку, при которой он прикажет расстрелять осуждённого холостыми патронами, а затем они с Флорией с помощью пропускной грамоты покинут Рим. Предметом сделки с другой же стороны становится сама Тоска. Согласившись, певица вдруг замечает на столе с блюдами и вином нож и убивает Скарпиа, ругая и проклиная его. Забирает из его рук грамоту, кладёт распятье ему на грудь и уходит.
ДЕЙСТВИЕ ТРЕТЬЕ
Площадка на башне тюремного замка Сант-Анджело.
Открывается песней пастуха об утерянной любви и смерти. Марио желает написать письмо Тоске перед казнью, но придаётся размышлениям. Приходит Тоска и рассказывает их план с подставной казнью, открывает ему, что произошло в кабинете. Обрадованные, они воспевают свою любовь друг к другу до того, как часы бьют четыре и приходит время казни. Но Скарпиа снова обманул девушку и патроны были настоящими. Скорбящую у тела Тоску уже собираются осудить за убийство, когда она вскрикивает, что своей жизнью будет платить не полиции, а Богу, и спрыгивает с края площадки.
